En el campo de la medicina, los valores de referencia se definen como el conjunto de valores que el médico utiliza para interpretar los resultados de las pruebas en un paciente.

Los intervalos de referencia se establecen realizando el análisis en cuestión a un número muy elevado de individuos de características similares, y observando lo que parece ser "típico" en ellos.

Para determinar los rangos de referencia, los laboratorios pueden llevar a cabo ellos mismos el estudio para las pruebas que les interesan, pueden adoptar rangos de referencia proporcionados por proveedores de reactivos e instrumentos, pueden adoptarlos de otros laboratorios, o pueden citarlos de la bibliografía.

• El paso más importante cuando se pretende establecer un rango de referencia es la definición de la población, es decir, el grupo de personas que quedará representado en el rango de referencia. En función de las pruebas y de los factores que pueden influenciar en el resultado, las poblaciones de referencia se pueden seleccionar en base a la edad, sexo, raza, estado de salud y/o historia clínica.
• Posteriormente, se realiza bajo las mismas condiciones la prueba a un elevado número (mínimo 120) de personas que cumplan con el perfil deseado y se analizan los resultados obtenidos.
• Normalmente, los rangos de referencia incluyen los valores analizados estadísticamente que representan al 95% central de la población de referencia.

 VALORES DE REFERENCIA EN HEMATIMETRÍA DE URGENCIAS

Como todos sabemos la química clínica estudia los constituyentes químicos orgánicos e inorgánicos tanto de origen endógeno como exógeno, de los seres vivos. El objetivo primordial de la química clínica es la detección de las variaciones en estos constituyentes originadas por la propia actividad fisiológica o por circunstancias patológicas, aportando una serle de valores cuantitativos, con fines preventivos, diagnósticos y de control de tratamiento. Estos valores deben ser interpretados en relación a valores similares obtenidos en condiciones fisiológicas.

Por lo tanto un valor de referencia es el resultado de una medición de una magnitud particular realizada con fines comparativos en un individuo, llamado individuo de referencia que cumple unos requisitos determinados.

Por lo tanto el laboratorio clínico debe proporcionar resultados adecuados como disponer de intervalos de referencia correctos para realizar una mejor interpretación de los resultados de los pacientes. Los intervalos de referencia de un parámetro biológico dependen de la población inicial y del procedimiento de medida. La variabilidad metrológica es la principal razón por la que diferentes procedimientos de medida proporcionan diferentes resultados.

A partir de una población definida se pueden obtener diferentes individuos seleccionados con fines comparativos mediante unos criterios determinados en cada caso. Al conjunto de todos los individuos de referencia se le conoce como población de referencia. A partir de una población de referencia, seleccionando un subconjunto constituido por el número adecuado de individuos para que sea representativo de dicha población, se obtienen las muestras de referencia. A partir de las cuales se obtendrán los diferentes valores de referencia que formarán la distribución de probabilidad en la que se definirán unos determinados límites de referencia, definidos como el valor de la distribución que excluye con una probabilidad determinada, una fracción de dicha distribución. Los límites de referencia definirán por tanto el intervalo de referencia siendo los valores que quedan incluidos entre ambos límites de referencia.

Los límites de referencia separan los resultados de individuos que puedan verse afectados por la enfermedad de los que probablemente no se verán afectados, pero no son siempre valores de decisión clínica. Los valores de decisión se obtienen de estudios clínicos y se definen habitualmente por consenso.

Al obtener el valor de una determinada magnitud en un individuo este puede ser comparado tanto con los valores, distribuciones, límites o intervalos de referencia obtenidos anteriormente.

Al ser competencia del laboratorio de química clínica la producción e interpretación de valores analíticos, Ie corresponde eI establecimiento de valores de referencia en función de la población a la que presta sus servicios y de la metodología que utiliza.

La calidad de los resultados del laboratorio depende también de la calidad de los límites con los que se comparan. Ante la dificultad de establecer un intervalo a partir de una muestra estadística de la población atendida se proponen otros procedimientos clasificados según su impacto en la toma de decisiones clínicas siguiendo un modelo jerárquico.

Los valores de decisión clínica son valores obtenidos de estudios clínicos, consensuados a nivel nacional o internacional. Los valores de decisión, cuando existen, sustituyen los límites referencia; están en lo posición más alta de la jerarquía.

Los valores de referencia obtenidos de una muestra de la población atendida por el laboratorio están también en lo más alto de jerarquía. La muestra de la población está formada por un mínimo de 120 individuos supuestamente sanos y seleccionados directamente para el estudio de los valores de referencia.

Los valores de referencia multicéntricos implica la producción de valores en colaboración entre varios laboratorios ya que supone un esfuerzo menor. En un estudio multicéntrico la suma de todos los coeficientes de variación intralaboratorio generará un intervalo de referencia de mayor amplitud, pero en cambio será más fácil conseguir un número mayor de individuos de referencia por lo que a su vez reducirá el intervalo.

Se puede adoptar el intervalo de referencia de una fuente externa, valores proporcionados por el fabricante de los equipos, referencias bibliográficas, etc. Se debe realizar una validación de estos valores bien de forma objetiva a partir de una serie pequeña de valores de referencia propios. O bien de una forma subjetiva presuponiendo que los métodos de medida y las poblaciones de ambos laboratorios son similares.

Por ultimo en la posición más baja de la jerarquía, se encuentra la adopción de un intervalo de referencia de un folleto comercial o de un libro sin verificar su aplicabilidad.

Algunos autores proponen utilizar resultados analíticos de pacientes disponibles en la base de datos del laboratorio. Mediante distintos algoritmos se seleccionan los valores que representan la población sana. Es un modelo distinto al propuesto por el instituto de estándares clínicos y del laboratorio y por la federación internacional de química clínica y medicina del laboratorio. Es difícil posicionarlo en la lista expuesta.

En teoría, los valores de referencia se pueden obtener de individuos con buena salud, que padecen una enfermedad, que pertenecen a un grupo de riesgo o que toman algún medicamento. Los individuos que cumplen las condiciones definidas en un estudio forman parte del grupo de referencia. Sin embargo, la gran mayoría de valores de referencia publicados son valores de referencia fisiológicos, obtenidos de individuos supuestamente sanos. Por lo general los laboratorios e incluso los fabricantes dedican poco tiempo a establecer los intervalos de referencia, utilizando a menudo los valores bibliográficos sin verificar su aplicabilidad.

En la producción de Valores de Referencia deben tenerse en cuenta:

• Los criterios de salud que caracterizan a los Individuos de Referencia, y que por tanto constituyen los criterios de inclusión en la Muestra de Referencia.
• Los factores de variación biológica que eventualmente puedan exigir la estratificación de la Muestra de Referencia, estimando Valores de Referencia para cada grupo.
• Un control riguroso y continuo de la calidad analítica utilizada.
• La aplicación de métodos estadísticos apropiados en la obtención de los Valores de Referencia.

La producción de valores de referencia será necesaria:

• Al instaurar una nueva magnitud
• Cuando se introduce un nuevo método de medida con características metrológicas distintas
• Cuando algunos resultados fuera del intervalo de referencia no están justificados
• Para verificar o validar los intervalos de referencia adoptados o transferidos.

La producción de los valores de referencia y la posterior estimación del intervalo debe llevarse a cabo de acuerdo a un protocolo bien definido y siguiendo una secuencia de operaciones como las descritas a continuación:

1. Diseñar un cuestionario específico para el estudio en cuestión con los criterios de selección, exclusión y partición de los individuos de referencia
2. Seleccionar un número de individuos de referencia que cumplan los criterios de selección y de acuerdo al nivel de confianza de cada límite de referencia
3. Proporcionar al personal responsable de la obtención de la muestra y a los individuos de referencia las instrucciones pertinentes y un documento para el consentimiento informado
4. Realizar el procedimiento analítico siguiendo los protocolos habituales del laboratorio para las muestras de pacientes
5. Inspeccionar los valores de referencia obtenidos y aplicar los algoritmos matemáticos correspondientes
6. Documentar todos los procesos de producción de valores de referencia

La población de referencia suele ser una entidad desconocida, el número de individuos que la componen es inmenso, se recurre al muestreo de un número limitado de individuos representativos de dicha población. El instituto de estándares clínicos y del laboratorio recomienda, en primera elección, establecer el intervalo de referencia con un método no paramétrico y un mínimo de 120 valores para cada grupo o subclase. Cuanto más estrictos seamos al formar grupos y subclases, mejores resultados obtendremos, pero más difícil será formar grupos de 120 individuos con todos los criterios de selección y exclusión requeridos. La selección De un gran número de individuos supuestamente sanos, directamente con vistas a la Determinación de los valores de referencia, es posiblemente la parte más laboriosa del Todo el proceso de producción de los valores de referencia.

La selección de Individuos de Referencia es de capital importancia en la producción de Valores de Referencia ya que la utilidad de tales valores dependerá de la coherencia y representatividad de la Muestra de Referencia.

Como se ha comentado anteriormente un individuo de referencia es una persona sana que pertenece a la comunidad atendida por el laboratorio, seleccionada en función de criterios como edad, sexo u otras condiciones relevantes. La selección del individuo de referencia puede precisar una variedad de exámenes tales como un cuestionario, una historia clínica, una exploración física o quizás también unas pruebas de laboratorio. Los criterios de selección o exclusión del individuo de referencia dependen también del uso que se haga de los valores de referencia y de los recursos disponibles.

Al no existir criterios universales de individuo sano se imponen unos criterios de inclusión y exclusión bien documentados. Un cuestionario de salud será el primer paso. Se deben plantear preguntas con respuestas simples.

La selección de los individuos de referencia puede hacerse a priori o a posteriori. En la selección a priori a partir del cuestionario y en función de los criterios de selección establecidos se seleccionan a los individuos de referencia a partir de los cuales se obtienen los intervalos de referencia.

En la selección a posteriori a partir de un grupo de individuos supuestamente sanos. Tras analizar las muestras se aplican los criterios de exclusión y partición obteniéndose a continuación los intervalos de referencia.

Una vez seleccionada la muestra de referencia, se lleva a cabo el proceso de medición de los valores de los que se desea estimar los intervalos de referencia, para ello se deben tener en cuenta consideraciones pre analíticas como la obtención y manipulación de la muestra y posibles incidencias que deben quedar documentadas. En los procedimientos de medida se debe evaluar previamente el sistema de medida garantizando la calidad metrológica.

A continuación se procede a realizar el análisis estadístico de los datos obtenidos para ello en primer lugar se representan los histogramas o diagramas de cajas para poder analizar el grado de simetría, apuntamiento de la distribución y la existencia o no de datos atípicos.

Un valor es atípico cuando no parece pertenecer al grupo de referencia estudiado. Las herramientas básicas para la detección de los resultados atípicos son la representación gráfica y las pruebas estadísticas como las de Dixon y de Tuque. Estas herramientas son útiles para identificar los valores atípicos, no para retirarlos de forma indiscriminada del grupo a menos que se halle una causa probable que justifique esta acción. Los valores atípicos pueden pertenecer a la distribución de referencia.

Antes de eliminar un resultado atípico se recomienda averiguar si se debe a una muestra inadecuada o si se trata de un error de medida o bien el individuo de referencia no cumple los criterios selección. Una vez hallada la causa probable el dato atípico este puede ser eliminado del grupo de referencia. La eliminación o inclusión de los valores atípicos es un reto.

Para evitar el efecto de los valores inadecuados se insiste en:

• Seleccionar directamente los individuos de referencia
• Aplicar los criterios de partición
• Minimizar la variación biológica
• Minimizar la variación metrológica

A continuación se debe determinar si la distribución de probabilidad de los valores obtenidos a partir de las muestras de referencia se ajustan de forma adecuada a una curva de probabilidad normal o no, para ello existen varios métodos, se puede rea lisar un gráfico de normalidad en donde se representa los valores obtenidos frente a los valores que se deberían obtener si la distribución siguiese la normalidad, si se observa una línea recta se puede decir que la distribución estudiada provienen de una distribución normal.

Los métodos más potentes para determinar la normalidad de una distribución es mediante test de contraste de hipótesis bien mediante el test de sapero mil, o bien con el test de Kolmogorov Smirnov.

El conjunto de resultados obtenidos con los individuos de referencia no es útil para efectuar comparaciones, es conveniente calcular algunos parámetros que caracterizan al grupo de referencia. Los límites de referencia se calculan delimitando un intervalo central que incluye un determinado porcentaje de valores. Para la mayoría de magnitudes se retiene por convenio el 95% de los valores de la distribución de referencia, entre los percentiles 2,5 y 97,5. Para establecer los límites de referencia se pueden elegir varios métodos: paramétrico, no-paramétrico o robusto.

Según el instituto de estándares clínicos y del laboratorio el método recomendado para establecer los límites de referencia es El no-paramétrico. No se hacen suposiciones sobre el tipo de distribución de probabilidad de los valores de referencia. Para obtener los límites de referencia se utiliza el método basado en los números Ordenados. Los resultados se ordenan de menor a mayor desde 1 hasta n, y se calcula el percentil 2,5 y 97,5.

El intervalo de referencia queda definido entonces como los valores comprendidos entre los percentiles 2,5 y 97,5.

Una vez obtenidos los intervalos de referencia para cada magnitud, o bien si se decide adoptar un intervalo de referencia de una fuente externa estos deben validarse para verificar que se cumplen los requisitos para la adopción o transferencia de los valores de referencia.

El procedimiento para llevar a cabo una validación de los intervalos de referencia comienza seleccionando 20 individuos de referencia propios, estas muestras se analizan en distintas series analíticas. A continuación se calcula N como el número de valores fuera de los límites originales y se interpretan los resultados del siguiente modo:

• Si N es menor o igual a 2 se acepta el nuevo intervalo
• Por el contrario si es mayor a 2 se analiza si N es mayor a 4, si es mayor a 4 se rechaza el nuevo intervalo de referencia pero si es menor se repite el procedimiento con otros 20 individuos de referencia.

A continuación se muestran los resultados de aplicar la metodología y los procedimientos descritos anteriormente para la obtención de los intervalos de referencia para los diferentes parámetros determinados en el área de hematología de urgencias. Los parámetros utilizados hasta el momento se obtuvieron a partir de diferentes referencias bibliográficas y siguiendo las recomendaciones de las guías medicas de hematología.

En nuestro caso se recomendaría realizar un estudio más detallado para la obtención de los intervalos de referencia de la población a la que da servicio nuestro hospital.

Se trata de un análisis preliminar ya que no se ha dispuesto de tiempo para poder llevar a cabo una correcta selección de individuos de referencia.

Por lo que la selección de individuos se ha realizado a posteriori, se han analizado 1364 peticiones de individuos supuestamente sanos a los que se les solicitaba una analítica de preoperatorios entre los meses de septiembre del 2020 y febrero del 2021.

De estas 1364 peticiones 649 corresponden con hombres con edades comprendidas entre 16 y 92 años y 715 peticiones corresponde a mujeres entre 14 y 94 años.

A cada uno de los pacientes se les realizo un hemograma completo mediante el contador hematológico Sismes XN-1000 disponible en el laboratorio de urgencias determinando los diferentes parámetros hematológicos, como recuento de leucocitos y su diferencial, número de hematíes, hemoglobina, etcétera.

Una vez se dispone de todos los valores de estos parámetros se aplican diferentes criterios de exclusión definidos por la organización mundial de la salud. En el caso de los hombres se excluyeron aquellos individuos que presentaron valores de leucocitos por debajo de 4000 o por encima de 12500 leucocitos por micro litro, valores de hemoglobina inferior a 12 o superior a 18 g/del y un número de plaquetas inferior a 150000 por micro litro.

En el caso de pacientes de género femenino se excluyeron aquellas con valores de leucocitos inferiores a inferiores a 4000 y superiores a 12000 leucocitos por micro litro, valores de hemoglobina inferior a 11 o superior a 18 g/del y plaquetas por debajo de 150000 unidades por micro litro.

A modo de ejemplo, a continuación se muestra el análisis estadístico realizado para la determinación del intervalo de referencia de recuento leucocitario en hombres.

En primer lugar se representa el histograma y el diagrama de cajas para este parámetro. En ambas representaciones se aprecia que la distribución no es simétrica presentando una ligera cola hacia la derecha, no presenta apuntamiento y no se observan datos atípicos que pueden no pertenecer a la distribución.

Analizando el gráfico de normalidad de la distribución observada, aparentemente no se ajusta de forma correcta a una distribución normal ya que se observan desviaciones importantes de la linealidad en ambos extremos de la distribución.

Mediante los distintos test propuesto para el contraste de hipótesis de normalidad, el test de Sapero Wok rechaza que esta distribución se ajuste de forma adecuada a una distribución normal. Mientras que el test de Kolmogorov Smirnov indica que no se puede rechazar que la distribución provenga de una población que se ajuste a una distribución normal.

Analizando tanto el histograma como los diferentes test y gráficos de normalidad es aconsejable suponer que la distribución no se ajusta de manera correcta a una distribución normal en el rango analizado, ya que presenta asimetría y desviaciones importantes en las colas de la distribución, se procede a determinar el intervalo de referencia siguiendo un método no paramétrico.

Para la determinación de los límites del intervalo de referencia se calculan el valor del percentil 2,5 y 97, 5, obteniendo en cada caso un límite inferior de 4620 leucocitos por micro litro y un límite superior de 11700 leucocitos por micro litro.

Ambos límites determinan por tanto el intervalo de referencia calculado a partir de nuestra población de referencia.

El intervalo de referencia utilizado actualmente está comprendido entre 4000 y 11000 leucocitos por micro litro, comparándolo con el calculado mediante este análisis se observa que este último se desplaza ligeramente hacia la derecha.

Este mismo proceso se realizó para cada uno de los parámetros informados en hematología de urgencia por nuestro laboratorio tanto en hombres como mujeres, a continuación se muestra un resumen en el que se comparan los intervalos de referencia calculados con los utilizados actualmente.

Aunque en todos los parámetros se observan variaciones en muy pocos casos se podría decir que las diferencias son significativas. Sería recomendable realizar un estudio más exhaustivo realizando una correcta elección de individuos de referencia para determinar de manera más precisa los intervalos de referencia ya que como se observa en este estudio preliminar se aprecian pequeñas diferencias en los que los intervalos son menos conservadores o se desplazan hacia otros valores.

Cabe destacar el valor de las plaquetas en el que el intervalo actual tiene como límite inferior 150000 plaquetas por micro litro en ambos sexo, este valor es el valor aceptado por la organización mundial de la salud como valor patológico.

En los intervalos de referencia calculados el límite inferior se encuentra por encima de ese valor patológico por lo que sería más adecuado.

También se observan una importante diferencia en el porcentaje de granulocitos inmaduros el valor actual es de inferior al 3% tanto en hombres como mujeres mientras que los valores calculados indican intervalos inferiores del 0,9% para hombres y de 0,7% para mujeres

A excepción de la sangre de los neonatos o las mujeres embarazadas, la presencia de los granulocitos inmaduros en la sangre periférica indica una respuesta en su fase inicial ante una infección, una inflamación u otros estímulos de la médula ósea. Por lo que no deberían aparecer en individuos sanos, por lo tanto el valor de referencia calculado se ajusta de forma más adecuada a la realidad de un individuo sano y sería recomendable estudiar su posible implantación como valor de referencia para el contaje de granulocitos inmaduros.