CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas
Las aplicaciones de los sistemas CRISPR- Cas han ido evolucionando en los últimos años desde que se descubrió su presencia en bacterias. Desde entonces se ha propuesto su uso en diferentes campos como en agricultura, estudio de enfermedades de base genética en modelos celulares y animales, en elaboración de alimentos fermentados, en la resistencia a antibióticos en bacterias y como posible terapia génica.
Descubrimiento de los sistemas CRISPR-Cas
1987: Yoshizumi Ishino descubre la existencia de secuencias repetidas palindrómicas en el ADN de Escherichia Coli.
1993: Francisco J. M. Mojica, mediante la secuenciación del parte del genoma de bacterias arqueas halófilas que habitaban en las salinas de Santa Pola, identifica unas secuencias palindrómicas de 30 pares de bases separadas entre sí por fragmentos de 36 pares de bases, los denominados espaciadores.
2000: El grupo de Francisco J. M. Mojica encuentran, buscando en bases de datos, un gran número de estas secuencias repetidas en bacterias, arqueas y mitocondrias y proponen el nombre de CRISPR que significa “Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas”.
2002: Un grupo de microbiólogos holandeses describen un conjunto de genes que codifican para nucleasas que están asociados a las secuencias CRISPR (los genes cas o asociados a CRISPR)
2005: Se descubre que algunos de los espaciadores de los sistemas CRISPR se derivan de fuentes de ADN de virus y plásmidos. El grupo de investigación de Francisco J. Mojica propone que los espaciadores asociados, pueden formar parte de algún sistema inmune de las bacterias.
2008: John van der Oost demuestra que en la bacteria coli E-Scherichia , los espaciadores, que se derivan de fago, se transcriben en ARN, denominado ARN CRISPR (crRNAs), que se une al ADN del virus y guía a las proteínas Cas hacia el ADN objetivo para realizar el corte de doble cadena.
2009: Se demuestra que CRISPR-Cas9 crea roturas de doble cadena de ADN diana en posiciones precisas y también se confirma que Cas9 es la única proteína necesaria para la escisión en el sistema de CRISPR-Cas9.
2011: Emmanuelle Charpentier de la Universidad de Umee realiza una pequeña secuenciación de ARN en Streptococcus pyogenes que contiene un sistema de CRISPR-Cas9 y descubre que además de la crRNA, existe un segundo ARN que llama transactivación de CRISPR ARN (tracrRNA). Además demuestra que tracrRNA actúa conjuntamente con el crRNA para guiar a Cas9 hacia sus objetivos.
2012: las científicas Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna de la Universidad de California en Berkeley, demuestran cómo utilizar CRISPR como herramienta de edición programable, que sirve para cortar cualquier cadena de ADN in vitro.
2013: el investigador Feng Zhang adapta con éxito el sistema CRISPR-Cas9 para la edición del genoma en células eucariotas, para ello diseñan dos genes ortólogos diferentes Cas9 y demuestran la escisión específica del genoma en células humanas y de ratón.
EL ORIGEN DE CRISPR
El genoma de las bacterias está constituido por dos cadenas de ADN circular siendo estas cadenas complementarias entre sí. Cuando leemos el genoma que son aproximadamente 4 o 5 millones de letras, vemos una serie de repeticiones que se repiten varias veces a lo largo del genoma y que están espaciadas entre sí. Cada una de estas unidades repetidas se denomina CRISPR que son “Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas”. Tras cada repetición se encuentran segmentos cortos de ADN espaciador procedente de ADN de virus bacteriófagos. Muy cerca de estas repeticiones se pueden encontrar los genes cas que codificaban para un tipo de proteínas nucleasas que son las ejecutoras de la actividad CRISPR.
MECANISMO DE ACCIÓN
Las bacterias al igual que los humanos van a ser infectadas por virus, que van a reconocer a la bacteria por receptores específicos en su membrana. El virus va a introducir su material genético en el interior de la bacteria y va a utilizar la propia maquinaria de la bacteria para producir miles de partículas víricas, que van a romper la envoltura de la bacteria y se van a liberar al medio para infectar a otras. Las bacterias que sobreviven al ataque del virus van a guardarse un fragmento de ADN del virus y lo van a incorporar como espaciador en su sistema CRISPR-Cas y lo conservan generación tras generación. Estos espaciadores se van a transcribir a ARN denominado “ARN CRIPR” (crARNs) que va hacer de guía para la proteína Cas y que se unirán al ADN del virus invasor en el caso de que exista una segunda infección por el mismo virus.
Cuando el mismo virus vuelve a infectar a la bacteria, el crARN correspondiente al espaciador de ese virus se va a unir a la doble cadena de ADN del virus por complementariedad. Una vez se ha unido a la doble cadena de ADN con ayuda del ARN de transactivación (tracrRNA) van a guiar a la proteína Cas 9 que es una endonucleasa que va a producir un corte de la doble cadena del ADN del virus, impidiendo así la infección. Por ello, el sistema CRISPR-Cas se considera un sistema de inmunidad adquirido en diferentes organismos.
CRISPR-CAS 9 COMO HERRAMIENTA DE EDICIÓN GÉNICA
En el 2012 las científicas Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna demostraron cómo utilizar CRISPR como herramienta de edición programable, que sirve para cortar cualquier cadena doble de ADN in vitro. De esta forma es posible programar el sistema para que se dirija a una posición específica de un ADN cualquiera y cortarlo, para ello utilizan el sistema CRISPR más simple que se basa en una proteína llamada Cas 9. Demostraron que valía con la información de Cas9 y un ARN guía que tenga la secuencia complementaria del fragmento que quieras cortar, mezclas esto con el fragmento en el que quieras producir un corte, y la proteína Cas 9 irá donde le dirija ese ARN guía y cortará en la posición que le indique.
La proteína Cas 9 hace un corte de doble cadena, actúa como unas tijeras moleculares sobre el ADN. El sistema CRISPR tiene la capacidad de dirigirse a una secuencia en concreto. Una molécula de ARN de 20 ribonucleótidos (crARN) se aparea con 20 nucleótidos de la cadena de ADN y la la proteína Cas9 es una enzima de restricción con alta especifidad que va a producir el corte en un lugar específico.
Al producirse un corte en la doble cadena de ADN se va a romper la continuidad física y se puede perder información en la siguiente ronda de división en los siguientes ciclos celulares, por ello la célula dispone de dos mecanismos de reparación del ADN.
Existen dos mecanismos de reparación:
Unión de extremos no homóloga:
Se detecta este corte y se empieza a degradar y añadir nucleótidos al azar con un efecto cremallera. Probablemente se altere la estructura original y se insertará o deleccionarán nucleótidos, por lo que tendríamos los llamados “Indels” y se producirá una disrupción génica. Ese gen va a dejar de funcionar. Nos basta para generar un mutante cortar en una zona concreta del ADN. Esto nos interesa en el que caso que queramos perder la funcionalidad de un gen.
Reparación directa homóloga:
Si le damos al sistema una secuencia que es homóloga a las zonas colindantes al corte y que contienen secuencias nuevas, estas secuencias serán integradas ya que la célula lo utilizará como molde. Cuando tenga que reparar intentará seguir este molde e introducirá secuencias que antes no estaban, bien se puede incluir una mutación o se puede quitar la mutación y restaurar la secuencia correcta. CRIPSR solo corta el DNA pero dispara el proceso de reparación.
Estas dos formas de reparación nos permiten estudiar la funcionalidad de un gen, estudiar una enfermedad de base genética que tenga una mutación, inserción o sustitución.
Edición del genoma
Elementos necesarios
En primer lugar tenemos la secuencia objetivo del ADN de doble cadena que queremos cortar. Tendremos un ARN guía que está formado por el ARN que se une a la secuencia objetivo y un ARN de transactivación que indica a la proteína Cas 9 dónde se tiene que posicionar para realizar el corte. Y por último la proteína Cas 9 que es la endonucleasa que realiza el corte-
Para facilitar la edición del genoma, se diseñó una guía ARN (ARNg), que era un ARN quimérico que contiene todos los componentes esenciales de ARNcr y tracrRNA. Se han desarrollado múltiples variantes de CRISPR/Cas9, que reconocen secuencias de 20 o 24 nt que coinciden con secuencias de gRNA diseñadas y secuencias de PAM de 2–4 nt en los sitios objetivo. Por lo tanto, CRISPR / Cas9 puede teóricamente apuntar a una secuencia de ADN específica con 22–29 nt, que es única en la mayoría de los genomas. Sin embargo, estudios recientes observaron que CRISPR / Cas9 tenía una alta tolerancia a los desajustes de pares de bases entre el ARNg y su secuencia diana complementaria.
Distintas funciones del Sistema CRISPR
Aplicaciones de CRISPR-Cas9
En bacterias:
Producción de productos fermentados para impedir la contaminación de cultivos de bacterias por virus.
Se puede realizar el tipaje de bacterias según los espaciadores que contengan.
Resistencia a antibióticos
Diseño de antimicrobianos selectivos.
Crear modelos celulares o animales de enfermedades con base genética
Realizar modificaciones epigenéticas
Cultivos resistentes a condiciones extremas
Retardar la maduración de frutas
Ganados con mayor masa muscular
Órganos animales seguros para transplante en humanos
Curar/prevenir enfermedades. Virus: VIH, herpes, hepatitis B, mononucleosis. infecciosa.
Mosquitos resistentes a la Malaria
Terapia génica somática
Tratamientos con CAR-T.
Limitaciones de CRISPR:
Off target: Pueden producirse cortes en otras secuencias que no son la diana objetivo.
Inmunogenicidad: Los sistemas CRISPR-Cas proceden de bacterias y pueden desencadenar una respuesta inmune, si hemos estados expuestos a una infección previa por ese microorganismo. Ej: Streptococcus Pyogenes.
Supervivencia de las células cambiadas genéticamente.
No podemos controlar la eficacia en la reparación homóloga (HDR).
Eficiencia, especifidad del tejido y efectividad de la transferencia.
Mosaicismos: Puede que los cambios no se produzcan en todas las células.
Conclusiones
- El sistema CRISPR-Cas 9 es un mecanismo de inmunidad adaptativa presente en multitud de organismos que se está utilizando para la edición génica.
- Se produce un corte en la doble cadena del ADN.
- Elementos necesarios son: una endonucleasa (Cas 9), un ARN guía y el ADN de interés.
- Es una herramienta fácil de usar y barata.
- Permite crear modelos de enfermedad.
- Curar/prevenir enfermedades.
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